Основные мишени препаратов прямого противовирусного действия для терапии инфекции SARS-CoV-2

В геноме SARS-CoV-2, содержащем около 30000 нуклеотидов, определено 17 открытых рамок считывания (табл. 1) [1-3], которые кодируют до 30 белков [4, 5]. Белки SARS-CoV-2, а также взаимодействующие с ними белки человека рассматриваются как фармакологические мишени, воздействие на которые может быть использовано для терапии новой коронавирусной инфекции.

Примечание. Сформировано на основе записи NC_045512.2 в БД GenBank и публикации [5]. Данные по участкам, кодирующим структурные и вспомогательные белки, показаны жирным шрифтом и курсивом, соответственно. Координаты рамок включают терминирующие кодоны.

Различают три группы коронавирусных белков. Неструктурные (non-structural, nsp) белки образуются путем протеолитического процессинга полипротеина-предшественника, который кодируется рамкой ORF1a или ORF1ab. Эти белки участвуют в жизненном цикле вируса, обеспечивая, прежде всего воспроизводство вирусных РНК [6]. Структурные белки кодируются рамками S, E, M и N и формируют вирусные частицы (вирионы) на более поздних стадиях вирусного цикла [7, 8]. Белки S, E, M встроены в липидную оболочку вируса, а частицы N-белка связаны с РНК-геномом, образуя нуклеокапсид (Рисунок 1).

Ряд рамок кодирует вспомогательные белки (accessory proteins), которые не участвуют в воспроизводстве вируса, но взаимодействуют с хозяйскими белками, обеспечивая, в том числе, защиту от врожденного иммунитета [9, 10].

На рисунке 2 представлен жизненный цикл вируса SARS-CoV-2 с информацией о возможных механизмах действия некоторых рассматриваемых в литературе препаратов, потенциально обладающих антикоронавирусным действием.

Инфекционный цикл вируса SARS-CoV-2 состоит из нескольких этапов: прикрепление к клетке, проникновение в клетку, синтез РНК и белка, сборка вириона и высвобождение вирусных частиц из клетки.

1. Проникновение вируса в клетку

Прикрепление вириона с последующим проникновением вирусного материала осуществляется за счет взаимодействия вирусного гликопротеина S-белка с поверхностными структурами клетки. Он заякорен в вирусной оболочке в виде тримера. Каждый мономер состоит из двух субъединиц S1 (672 аминокислотных остатка) и S2 (588 остатков), которые образуются путем протеолитического расщепления из белка- предшественника S [12, 13]. Рецептор-связывающий домен S1 присоединяется к ангиотензинпревращающему ферменту 2-го типа (ACE2) человека [12]. Возможными рецепторами вируса также являются нейропилин [14], басигин [15], лектины [16], молекула повреждения почек 1 (KIM-1) [17] и ряд других белков [18, 19].

Множественность патологических процессов, происходящих в организме больного COVID-19, указывает на то, что число белков-рецепторов может быть гораздо больше, и список идентифицированных белков будет пополняться. Вместе с тем, опубликованные данные нуждаются в уточнении; так, например, в более поздней публикации роль басигина как возможного рецептора SARS-CoV-2 не была подтверждена [20].

Субъединица S1, индуцирующая выработку вируснейтрализующих антител, характеризуется высокой частотой мутаций, что создает проблемы при разработке средств вакцинопрофилактики и применении терапевтических антител. Это является важным обстоятельством, побуждающим к разработке ингибиторов взаимодействия S1 и ACE2 на основе фрагментов ACE2 [21; 22]. Осуществляется также поиск лигандов рецептор-связывающего домена на основе компьютерного моделирования с последующим тестированием in vitro [23].

Субъединица S2 обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембран. Расщепление S2 одной из протеаз хозяина, таких как TMPRSS2 или катепсин L, освобождает пептид слияния в N-концевой части S2. Насыщенный гидрофобными остатками пептид слияния взаимодействует с клеточной мембраной, запуская структурные перестройки белка, приводящие к слиянию мембран и поступлению вирусного материала в цитоплазму либо через внешнюю мембрану клетки, либо путем клатрин-опосредованного эндоцитоза [12].

Субъединица S2 рассматривается как перспективная мишень, поскольку достаточно консервативна у разных вариантов вируса. Исследован ряд препаратов, которые действуют на подструктуры S2 и ингибируют слияние вирусной и клеточной мембран [24].

S-белок участвует в формировании многоядерных синцитиев [25], что способствует распространению вируса между клетками и, вероятно, позволяет ему уклоняться от иммунного ответа. Образование синцитиев зафиксировано у пациентов с тяжелой формой COVID-19.

Взаимодействие S-белка с ACE2 при проникновении вируса путем эндоцитоза обуславливает снижение экспрессии ACE2 в клетках легких за счет лизосомального расщепления. Это рассматривается как важный фактор патогенеза, связанный с нарушением регуляции ангиотензин-рениновой системы [26]. Выраженность указанного эффекта зависит от структурных особенной S-белка у конкретного вирусного штамма.

2. Формирование неструктурных белков и их функции

Слияние вирусной и клеточной мембран обеспечивает выход вирусного материала в цитоплазму. Освободившаяся геномная РНК связывается с рибосомами и используется непосредственно как матрица для трансляции с двух рамок считывания ORF1a и ORF1ab, занимающих около двух третей генома. Остальные рамки считывания служат шаблонами для синтеза субгеномных мРНК, которые, в свою очередь, выступают как матрицы для ситнтеза структурных и вспомогательных белков [27].

Рамка ORF1a совпадает с начальной частью ORF1ab. Использование механизма “программируемого сдвига рамки” (frameshifting) обеспечивает синтез двух вариантов белкового продукта (полипротеина-предшественника) pp1a и pp1аb длиной 4405 и 7096 аминокислотных остатков, соответственно [28]. Полипротеин аутокаталитически расщепляется вирусными протеазами PLpro и 3CLpro (рисунок 3, табл). Образовавшиеся неструктурные белки (non-structural proteins) обозначаются по порядку их расположения – Nsp1, …, Nsp16 [6]. Короткая последовательность Nsp11 в составе pp1a (4393-4405) вследствие сдвига рамки исчезает как отдельный участок в составе pp1ab, совпадая по первым девяти остаткам с N-концевой частью Nsp12.

Белки Nsp1 и Nsp2 не включены непосредственно в репликацию вируса. Они взаимодействуют с клеточными структурами, отвечающими за синтез белка, что приводит, в том числе, к угнетению врожденного иммунитета.

Связываясь с субъединицей рибосомы 40S и вирусной мРНК, С-концевой участок Nsp1 перекрывает вход для хозяйских мРНК. В то же время, взаимодействие N-концевого домена nsp1 с 5’-нетранслируемой областью мРНК коронавируса открывает доступ для вирусных мРНК. Так происходит переключение белкового синтеза в сторону вирусных белков [29]. Помимо этого, Nsp1 участвует в расщеплении хозяйской мРНК [30], взаимодействует с белками, которые отвечают за экспорт клеточной мРНК из ядра [31]. Связывание Nsp1 c хозяйской праймазой [32] может нарушать репликацию ДНК человека.

Белок Nsp2 SARS-CoV-2 охарактеризован достаточно слабо. Делеция участка, кодирующего Nsp2 из геномов таких коронавирусов как SARS-CoV и MHV (вирус мышиного гепатита) приводит лишь к умеренному снижению вирусного титра [33]. Белки-ортологи Nsp2, экспрессируемые у SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS, взаимодействуют с хозяйскими белками, вовлекаясь в такие процессы как регуляция трансляции, эндосомальный транспорт, биогенез рибосом [34]. Полагают, что Nsp2 участвует в угнетении трансляции хозяйских генов с участием микроРНК [35].

Nsp3 – самый большой неструктурный белок у всех коронавирусов [36]. У SARS-CoV-2 он содержит 1945 остатков. В Nsp3 выделяют 14 структурно-функциональных участков (Рисунок 4). Среди его многочисленных функций отмечают протеолитический процессинг полипротеина-предшественника, который производится доменом PLpro. Не менее важно и участие Nsp3 в формировании репликативных органелл.

Домен PLpro – папаиноподобная цистеиновая протеаза, отнесенная к структурно-функциональному клану CA в БД MEROPS. Она обычно рассматривается как единая структура с убиквитин-подобным доменом Ubl2, который предположительно способствует связыванию протеазы с убиквитином [36]. Этот фермент расщепляет сайты Nsp1/Nsp2, Nsp2/Nsp3 и Nsp3/Nsp4 [37]. PLpro также отщепляет цепи убиквитина и ISG15 от хозяйских белков [37]. Ковалентное присоединение этих сравнительно небольших полипептидных цепей к модифицируемым белкам играет важную роль в реакциях врожденного иммунитета [38]. Такая специфичность обусловлена тем, что протеаза PLpro близка по структуре к деубиквитиназам семейства USP, экспрессируемым в том числе и у человека [39]. Поскольку деубиквитинирующие ферменты человека – это необходимый компонент регуляторных процессов, следует учитывать, что ингибирование PLpro может приводить к возникновению побочных эффектов.

У коронавирусов в ходе инфекционного процесса формируются репликативные органеллы, которые служат платформой для функционирования комплекса вирусных белков (Replication-transcription complex, RTC), осуществляющих репликацию и транскрипцию вирусных РНК. Репликативные органеллы представляют собой пузырьки, окруженные двойной мембраной (DMV), которые образуются из мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [40]. DMV экранируют возникающие при синтезе РНК двухцепочечные интермедиаты, которые распознаются рецепторами врожденного иммунитета [41].

Формирование DMV происходит при взаимодействии Nsp3 и Nsp4, имеющих в своем составе, соответственно, два и четыре трансмембранных участка [42]. Петли обоих белков, обращенные в просвет ЭПР, связываются между собой, инициируя искривление мембран ЭПР и отпочкование мембранных везикул (рисунок 5).

Процесс завершается путем стягивания мембран по принципу «застежки-молнии» за счет спаривания единиц белка Nsp6, каждая из которых заякорена в мембране ЭПР шестью спиралями [43].

С учетом описанного механизма представляется целесообразным поиск ингибиторов, нарушающих описанные взаимодействия. Потенциальные ингибиторы были предложены на основе виртуального скрининга, однако соответствующее экспериментальное тестирование не проведено [44].

Созревание DMV происходит при участии белков хозяина, необходимых для формирования аутофагосом - клеточных органелл с двойной мембраной [45]. Данные о влиянии Nsp6 на формирование аутофагосом также указывают на сходные механизмы формирования структур обоих типов [43].

Nsp3, будучи встроенным в двойную мембрану DMV посредством трансмембранных спиралей ТМ1 и ТМ2, образует поры, каждая из которых содержит по шесть субъединиц данного белка [46]. Эти каналы служат для транспорта геномных и субгеномных РНК между цитоплазмой и DMV, который осуществляется при взаимодействии Ubl1-домена Nsp3 c нуклеокапсидным белком N [47].

N-концевая область Nsp3 с доменами Ubl1 и Ubl2 на концах (рисунок 4), критически важна для процессов, которые запускают изменения в мембране ЭПР, необходимые для формирования DMV [48]. Этот участок включает в числе других три компонента cо сходной пространственной укладкой: Масro 1, Масro 2 и Масro 3.

Домен Macro 1 отщепляет от белков остатки AДФ-рибозы или поли-AДФ-рибозы, нарушая функции белков организма-хозяина, в том числе связанные с иммунитетом. SARS-CoV-2 c делециeй этого домена способен к репликации, но при этом высоко чувствителен к иммунным реакциям, опосредованным интерфероном гамма [49]. Macro 1 входит в надсемейство макродоменов, представленных в белках вирусов, бактерий и эукариот [50]. Два ингибитора Macro 1 были найдены путем виртуального скрининга на основе ингибиторов PARG (структурно сходного белка человека) и последующей кристаллизации в комплексе с мишенью [51]. Ряд ингибиторов Macro 1 был выявлен несколькими группами исследователей с помощью высокопроизводительного экспериментального скрининга [52].

Участки Macro 2 (SUD-N) и Macro 3 (SUD-M), сходны по структуре с Macro 1, но отличаются по функции. Вместе с субдоменом DPUP (SUD-C) они объединены в домен SUD, который, как полагают, взаимодействуя с факторами трансляции, способствует синтезу белков на вирусных мРНК [53]. Данные по связыванию SUB-N и SUB-C с олигогуаниновыми последовательностями РНК указывают на возможное участие SUD в работе репликативного комплекса [36].

Белок Nsp5 (главная протеаза, 3CLpro) расщепляет все протеолитические сайты в полипротеине, начиная с Nsp4/Nsp5 и заканчивая на Nsp15/Nsp16. Показано также, что 3CLpro расщепляет и хозяйские белки, в том числе и те, которые вовлечены в формирование реакций иммунного ответа [54-56]. 3CLpro активен в форме димера [57]. Протеазы указанного типа характеризуются трехмерной укладкой по типу химотрипсина. Несмотря на то, что значимое сходство последовательностей можно обнаружить только в пределах одного семейства, подобие трехмерных структур протеаз позволяет отнести их к одному надсемейству. Белки с таким типом пространственной укладки найдены у вирусов разных семейств, а также у эукариот, включая человека [58]. Согласно классификации MEROPS эти ферменты отнесены к структурно-функциональному клану PA.

Перспективное направление при поиске ингибиторов 3CLpro - разработка пептидомиметиков, имитирующих сайты протеолиза в белках-субстратах, с модификацией химических групп, связываемых карманами активного центра. На этой основе осуществлен молекулярный дизайн ингибитора нирматрелвир, внедренного в медицинскую практику в составе препарата паксловид [59].

PA-протеазы энтеро- и коронавирусов характеризуются сходными паттернами сайтов протеолиза в расщепляемых белках [60] (рисунок 6). Это служит доводом к репозиционированию ингибиторов протеаз, разработанных для других вирусов. Предложен ряд ингибиторов широкого спектра действия, которые подавляют репликацию как корона-, так и энтеровирусов [60]. Следует отметить что ранее был разработан ингибитор широкого спектра GC376, активный против норо-, корона- и пикорнавирусов (включают род энтеровирусов) как на уровне ферментативных тестов, так и клеточных моделей. Препарат показал эффективность при лечении перитонита кошек, вызываемого коронавирусом FIPV [61, 62].

При сопоставлении трехмерных структур с помощью метода DALI [63] было показано, что 3СLpro коронавирусов в большей степени сходны с протеазами энтеровирусов чем с протеазой NS3 вируса гепатита С (ВГС), которая также относится к надсемейству PA. Паттерны сайтов протеолиза, характерные для NS3 ВГС [64] существенно отличаются от паттернов, установленных для протеаз энтеро- и коронавирусов (рисунок 6). Этот пример указывает на перспективность структурных сопоставлений при репозиционировании ингибиторов вирусных ферментов.

Для сайтов, расщепляемых протеазами человека, не характерен глютамин в позиции P1. Полагают что это должно гарантировать низкую вероятность побочных эффектов для ингибиторов 3CLpro [66]. Исследования ингибитора помотрелвира, действующего на активный сайт 3CLpro, показали его эффективность in vitro против протеаз SARS-CoV-2 и других коронавирусов вместе с высокой селективностью в отношении протеаз человека [67].

Хотя мутации 3CLpro достаточно редки, вероятность появления резистентных штаммов нельзя исключать при применении в клинике противовирусных препаратов. Недавние исследования по оценке устойчивых к нирматрелвиру вариантов SARS-CoV-2 были проведены на культурах клеток, инфицированных SARS-CoV-2 или химерным вирусом везикулярного стоматита [68-70]. В этих исследованиях серия пассажей с нирматрелвиром приводила к появлению устойчивых мутантных форм. Отмечены мутации, приводящие к снижению чувствительности к нирматрелвиру более чем в 100 раз [68, 70]. Большинство этих мутаций идентифицированы в последовательностях, депонированных в хранилищах данных, – в том числе поступивших до клинического применения комбинации нирматрелвира в составе препарата Paxlovid [69]. Систематическое исследование естественных вариантов 3CLpro SARS-CoV-2 позволило выявить 22 мутации, которые ассоциированы с более чем десятикратным повышением устойчивости к нирматрелвиру. Все эти замены были локализованы в пяти аминокислотных позициях кармана, связывающего ингибитор [71]. С целью преодоления резистентности продолжаются работы по конструированию новых ингибиторов 3CL на основе модификаций химических групп в пептидомиметиках [72].

Еще один подход к нейтрализаци протелитической активности 3CLpro основан на технологии PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimeras), которая заключается в использовании химерной молекулы из двух компонентов - лиганда целевого белка и лиганда убиквитинлигазы Е3 [73]. Такая конструкция «притягивает» целевой белок к Е3, что приводит к убиквитинированию белка с последующей протеасомной деградацией. Использование соединений, сконструированных по указанному принципу, позволило значительно снизить уровень вирусных белков в клетках, инфицированных SARS-CoV-2 [74, 75].

Заслуживают внимания и исследования, направленные на поиск аллостерических ингибиторов, нарушающих димеризацию 3CLpro [76].

2.1 Репликативно-транскрипционный комплекс (RTC)

Коронавирусы имеют необычайно большой по сравнению с другими РНК-содержащими вирусами набор ферментов, связанных с воспроизводством и экспрессией вирусного генома [77]. Белки Nsp7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 и 16, собираются в RTC в составе репликативных органелл DMV (рисунок 7). В этом комплексе синтезируются новые копии РНК-генома и субгеномные матричные РНК структурных и вспомогательных белков [77].

Белок Nsp9 участвует в инициировании синтеза РНК [78]. Результаты недавнего исследования также указывают на то, что Nsp9 участвует в инициации транскрипции в кооперации с хозяйским белком SND1 [79].

Nsp10 образует вместе с N-концевым доменом (ExoN) Nsp14 корректирующий комплекс (proofreading complex) и активирует метилтрансферазу Nsp16 [77]. Область генома, кодирующая этот белок, непосредственно предшествует сайту сдвига рамки (frameshifting). Связываясь с рибосомой, Nsp10 участвует в регуляции сдвига рамки, который необходим для синтеза полноразмерного полипротеина pp1ab и формирования полного набора неструктурных белков [28].

Белок Nsp12 включает домены NiRAN и RdRp, соединенные промежуточным Interface-доменом [80, 81] (рисунок 8).

Домен NiRAN (около 250 остатков) присутствует в РНК-репликазах всех вирусов таксономического порядка Nidovirales. Он структурно сходен с протеинкиназами и проявляет фосфотрансферазную активность [82]. Этот домен участвует в формировании 5’кэпа [77]. Возможно также, что NiRAN обеспечивает ковалентное связывание между белком Nsp9 и монофосфорилированной РНК как промежуточный этап при синтезе 5’кэпа [83].

Домен RdRp (более 500 остатков) представляет собой РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая в комплексе с Nsp7 и Nsp8 осуществляет репликацию геномной РНК и транскрипцию субгеномных РНК [80]. Этот фермент относится к большой группе структурно и функционально сходных белков (DNA/RNA polymerase superfamily), осуществляющих функцию нуклеотидной полимеразы у вирусов и ряда других биологических видов [84, 85].

Нуклеотидные полимеразы РНК-содержащих вирусов, включая обратные транскриптазы ретровирусов, характеризуются сходными паттернами на уровне аминокислотных последовательностей. Соответствующие мотивы A-G включают функционально значимые консервативные остатки [86]. Сопоставление трехмерных структур RdRp SARS-CoV-2 со структурами других вирусных протеаз позволило локализовать в ее последовательности те же мотивы, формирующие активный сайт фермента (рисунок 5) [80, 81].

Более близкое сходство аминокислотных последовательностей RdRp обнаруживается у вирусов из разных семейств с положительным одноцепочечным РНК-геномом (запись в PS50507 БД PROSITE).

Таким образом, для репозиционирования лекарственных препаратов, активных против RdRp других вирусов, открываются широкие возможности.

Нуклеозидные аналоги ингибиторов RdRp, такие как ремдесивир и молнупиравир, разрабатывались как средства, действенные против вирусов с РНК-геномом, таких как ВИЧ [87] или ВГС [88]. Их активность связана с нарушением синтеза РНК за счет конкуренции с естественными нуклеотидами за встраивание в растущую цепь [89]. Спустя 18 месяцев после начала пандемии было проведено исследование более чем пяти миллионов последовательностей SARS-CoV-2, депонированных в БД GISAID, на наличие мутаций, обуславливающих резистентность к ремдесивиру in vitro [90]. Несмотря на интенсивное клиническое применение препарата, частоты этих мутаций оказались крайне низки.

Указанное выше надсемейство структурно-подобных ДНК/РНК-полимераз включает 16 белков человека, депонированных в рецензируемой части БД UniProt. В их число входит митохондриальная РНК-полимераза человека (POLRMT), которая ингибируется рядом нуклеозидных аналогов [91]. Хотя воздействие ремдесивира на этот фермент не носит выраженного характера, оно рассматривается как одна из возможных причин нежелательных кардиотоксических эффектов [92].

В качестве более селективных средств исследуются ненуклеозидные ингибиторы RdRp, которые блокируют вход РНК, либо связываются с аллостерическими карманами в структуре полимеразы, препятствуя необходимым для связывания РНК конформационным изменениям и тем самым подавляя активность фермента [93, 94].

Белок Nsp13 функционирует как хеликаза с использованием АТФ, расплетая двуцепочечные РНК-интермедиаты. Также этот белок участвует в формировании 5’кэпа [77]. Nsp13 относится к структурно-функциональному надсемейству SF1 хеликаз [95], которые встречаются как у вирусов, так и у других видов, включая человека [96]. В RTC присутствуют две копии Nsp13, связанных с разными субдоменами RdRp.

N-концевой домен белка Nsp14 (ExoN) в комплексе с Nsp10 проявляет активность корректирующей экзорибонуклеазы (proofreading). Фермент в процессе синтеза РНК удаляет нуклеотиды, нарушающие комплементарность шаблонной и растущей цепей [97]. Благодаря этому механизму, некоторые нуклеозидные аналоги неэффективны при лечении коронавирусных инфекций [77]. Виртуальный скрининг библиотеки нуклеозидных аналогов с последующей экспериментальной проверкой выявил перспективные соединения, ингибирующие как RdRp, так и ExoN и, таким образом подавляющие репликацию вируса [98].

С-концевой домен Nsp14 (N7-MTase) работает как метилтрансфераза при формировании 5’кэпа [77].

Белок Nsp15 (уридилат-специфичная эндорибонуклеаза, NendoU) препятствует развитию иммунных реакций. Как показано для SARS-CoV, этот фермент укорачивает полиуридиновые участки на 5’-концах минус-цепей, лимитируя уровень РНК-интермедиатов, которые служат сигналами для запуска реакций врожденного иммунитета [99].

Белок Nsp16 (2'O-метилтрансфераза, 2′-O-MTase), в сочетании с Nsp10, осуществляет второе метилирование 5’кэпа [77].

Формирование 5’-кэпа – важный этап при синтезе вирусной РНК. Эта группа необходима для поддержания стабильности РНК, запуска трансляции и защиты от клеточных экзонуклеаз [83]. Присоединение 5’-кэпа происходит в несколько этапов [77]. Nsp13 отщепляет гамма-фосфат от 5’-конца РНК. NiRAN-домен из Nsp12 присоединяет к РНК группу гуанозин-монофосфата. В завершение 5’-кэп метилируется метилтрансферазой Nsp14 (доменом N7-MTase), а затем метилируется Nsp16 (2′-O-MTase).

3. Структурные белки и сборка вириона. Высвобождение из клетки.

Субгеномные рамки считывания кодируют четыре структурных белка S, N, M и E, образующие вирусную частицу.

S-белок, участвующий в самом первом этапе жизненного цикла вируса охарактеризован ранее.

N-белок (419 аминокислотных остатков) формирует нуклеокапсид в форме спирали, которая содержит одну цепь геномной РНК и более 4000 субъединиц N-белка [100].

N-белок содержит два структурированных домена NTD и CTD, а также три неупорядоченных участка на N-конце (N-arm), между доменами (LKR) и на C-конце (C-tail). Основные остатки NTD-домена и других частей молекулы белка обуславливают ее связывание с РНК [101]. N-концевая часть CTD-домена также отвечает также за связывание РНК за счет бороздки, заполненной основными остатками [102], тогда как С-концевая часть – за димеризацию. Димеры N-белка укладываются в надструктуры более высокого порядка. В составе LKR выявлен участок SR, который связывается с Ubl1-доменом Nsp3, при взаимодействии N-белка с комплексом RTC [47], что обеспечивает обмен РНК между репликативными органеллами и цитоплазмой.

N-белок может перехватывать двухцепочечные РНК-интермедиаты, препятствуя развитию защитных реакций, таких как антивирусная РНК интерференция [103].

Несмотря на то, что нуклеопротеин локализован внутри вириона, антительный ответ на него выражен сильнее и развивается раньше в сравнении с поверхностным S-белком. Соответствующие серологические тесты помогают быстро оценить особенности инфекционного процесса [104]. Кроме того, N-белок рассматривается как стимулятор стабильного клеточного иммунитета [105]. Сочетание S- и N-белков в вакцинных конструкциях представляется перспективным направлением [106]. На основе генноинженерной конструкции, содержащей полноразмерный N-белок, а также фрагменты белков M, S и Е, отечественными учеными создан инновационный препарат КоронаДерм-PS для оценки Т-клеточного иммунитета при коронавирусной инфекции с высокой чувствительностью. Отобранные участки структурных белков включают высоко консервативные эпитопы среди различных штаммов SARS-CoV-2, что обеспечивает надежность диагностики. Безопасность и эффективность КоронаДерм-PS продемонстрированы в ходе слепого плацебо-контролируемого клинического исследования [107].

Мембранный белок (M-белок) содержит 222 аминокислотных остатка и формирует димер. Он играет ключевую роль в сборке и морфогенезе вирусных частиц [108]. N-концевой домен М-белка встроен в мембрану. C-концевой домен М-белка обращен в цитоплазму и в конечном счете локализуется внутри собранного вириона. Взаимодействие M-белка со структурными белками N, E и S необходимо для сборки вириона [109]. Эти мембранные белки после синтеза располагаются рядом в мембране ЭПР (рисунок 2) и мигрируют к месту сборки в промежуточном компартменте ERGIC. За счет взаимодействия между С-концевым доменом М-белка и нуклеокапсидом, последний “подтягивается” к месту сборки [108, 109]. Мембрана замыкается вокруг вириона, который поступает в аппарат Гольджи. Далее вирион включается в лизосому и покидает клетку путем экзоцитоза.

Оболочечный белок E включает 75 аминокислотных остатков. Центральный гидрофобный участок образует трансмембранную спираль. Эти спирали собираются в пентамер, действующий как ионный канал [110]. Таким образом, E-белок – типичный представитель семейства виропоринов, которые необходимы для сборки вирионов и их освобождения из клетки [111]. Блокаторы ионных каналов рассматриваются как потенциальные противовирусные препараты [112]. На примере других коронавирусов показано, что большинство молекул E-белка локализованы не в оболочке вируса, а в ЭПР, аппарате Гольджи и ERGIC – то есть в тех структурах, которые вовлечены в сборку и отпочкование вирионов [110].

4. Вспомогательные белки

Эти белки кодируются рамками (ORF) 3a, 3b, 3c, 3d, 6, 7a, 7b, 8, 9b, 9с и 10. Они не участвуют в репликации вируса, однако вовлечены в патогенез, включая защиту вируса от иммунных реакций [9]. Экспериментальные результаты показывают, что вспомогательные белки ингибируют продукцию интерферона, способствуют обострению воспалительных процессов, индуцируют неконтролируемый апоптоз, снижают антигенную презентацию, блокируют аутофагию, провоцируют стресс ЭПР [10].

Показано, что мутации, выключающие некоторые вспомогательные гены, некритичны для репликации SARS-CoV-2 [113] из БД GISAID. У пациентов, инфицированных вирусом с делецией, затрагивающей три неструктурных белка ORF7a, ORF7b и ORF8, отмечено сокращение сроков госпитализации. При этом, тяжесть заболевания и выраженность иммунного ответа были такими же, как у пациентов, зараженных вирусом “дикого” типа [114].

Самый большой вспомогательный белок ORF3a взаимодействует с белками клеточного транспорта и, таким образом, вероятно, вовлекается в процессы вирусного высвобождения и уклонения от иммунного ответа [115]. Делеция гена ORF3a приводит к значительному угнетению воспроизводства вируса в зараженных клетках [116].

5. Изменчивость белков SARS-CoV-2

Изменчивость белков вируса в ходе эпидемического процесса важна при разработке лекарств и вакцин. Данные по динамике мутаций у SARS-CoV-2 опубликованы в работе [117].

Вполне понятна высокая изменчивость S-белка как как мишени нейтрализующих антител. Такая популярная лекарственная мишень как Nsp5 (3CLpro) относительно консервативна, а Nsp12 (RdRp) более изменчива.

6. Белки человека как возможные мишени

С начала пандемии ковид 19 значительные усилия были направлены на разработку лекарств, действующих на белки человека (хозяйские мишени), непосредственно взаимодействующие с белками вируса или включенные в патогенез. Прежде всего стоит упомянуть о мишенях, для которых установлены, крайней мере in vitro, лиганды с противовирусным эффектом.

Блокада ACE2 нарушает взаимодействие этого рецептора с S-белком и, тем самым, перекрывает основной путь для входа вируса [18, 21].

Протеаза фурин расщепляет полипептид S по сайту S1/S2, вероятно, еще до выхода вириона из клетки [12], что способствует формированию функционального комплекса S1-S2 [118].

Трансмембранные сериновые протеазы (TTSPs), включая TMPRSS2, и катепсин L необходимы для активации пептида слияния путем расщепления S2-белка по сайту S2’. TTSPs действуют на поверхности клетки, а катепсин L в эндосоме. В обоих случаях расщепление белка S2 сопровождается структурной перестройкой S-белка, слиянием мембран и поступлением вирусного материала в цитоплазму [12, 13].

Лиганды рецептора сигма-1 (σ1R) часто идентифицируют при скрининге лекарств in vitro, направленном на выявление соединений, активных против коронавирусов [119]. σ1R – лиганд-управляемый шаперон, модулирующий процессы, связанные со стрессом эндоплазматического ретикулума – явления, которое развивается, в том числе, и при коронавирусной инфекции. Последняя, как уже отмечалось, сопровождается перестройкой внутренних мембран клетки. Показано взаимодействие σ1R с вирусным белком Nsp6, участвующим в формировании DMV [120].

Один из подходов к поиску хозяйских мишеней основан на выявлении белков человека, сходных с вирусными белками, путем трехмерного сопоставления [121]. Для определенных таким образом белков человека извлекаются установленные данные по белок-белковым взаимодействиям. Это позволяет наметить вероятные хозяйские мишени, которые могут взаимодействовать с белками вируса.

Сегодня ни один из препаратов, действующих на хозяйские мишени, группы не получил одобрения. Это связано, в том числе, с возможными побочными эффектами и с наличием дублирующих путей в жизненном цикле вируса [122].

Заключение

На данный момент вирусные мишени остаются ключевым предметом исследования при поиске соединений, активных против вновь выявленного патогенного вируса [122].

Сделан вывод, что при выборе лекарственных мишеней нового вируса следует ориентироваться на данные по белкам других вирусов, сходным с этими мишенями, и при этом уделять особое внимание структуре лиганд-связывающих карманов. Касательно этих белков следует учитывать сведения по активных против них лигандам, включая результаты тестирования in vitro и in vivo с четким пониманием механизма действия, а также результаты клинических испытаний и опыт терапевтического применения [122]. Этим критериям в наибольшей степени отвечают 3CLpro (nsp5) и RdRp (nsp12).

При разработке лекарственных средств, как на основе репозиционированных соединений, так и de novo, обращают внимание на структурные особенности белков-мишеней, обеспечивающих субстратную и ингибиторную специфичность. Это наглядно показано на примере протеаз энтеро- и коронавирусов, характеризующихся близким сходством как по трехмерной структуре, так и по паттернам протеолиза.

Ряд белков и белковых доменов SARS-CoV-2, таких как 3CLpro, PLpro, RdRp, Macro 1 и др., сходны с белками человека на уровне трехмерной организации и отнесены к соответствующим структурно-функциональные надсемействам. В связи с этим необходимо исследовать селективность ингибиторов для исключения или минимизации побочных эффектов. С другой стороны, такое сходство положено в основу поиска ингибиторов, блокирующих взаимодействие белков человека и вируса [121].

Сложности при разработке лекарств против COVID-19 связаны и с тем, что SARS-CoV-2 содержит довольно большой арсенал белков, которые, взаимодействуя между собой и белками человека, обеспечивают не только реализацию жизненного цикла вируса, но и защиту от реакций врожденного иммунитета.

Примером комплексного подхода к поиску эффективных антикоронавирусных соединений является изучение ингибиторов двойного действия против РНК-репликазы RdRp и корректирующей экзонуклеазы ExoN [98].

Цитируемая литература: