Ингибитор	K_i эксп., мкМ	K_i лит., мкМ
PF-00835231	0.004	0.00027
GC-376	0.03	0.06
Боцепревир	3.3	1.18
Телапревир	15.6	18 (IC50)

Ингибитор	EC₅₀ эксп., мкМ	EC₅₀ лит., мкМ
PF-00835231	70.73 ± 0.04	40 — 89
GC-376	17.74 ± 0.08	0.7 — 3.37
Боцепревир	106 ± 50	1.31 — 15.57
Телапревир	> 200	> 40
NHC	7.4 ± 3.6	0.30

Препарат	Результат
Вакцина КовиВак	Обнаруженные терапевтические эффекты проявляются в виде снижения частоты проявления клинических признаков инфекции вплоть до их полного исчезновения к концу эксперимента. Положительная динамика изменения массы тела животных с набором веса с 2 суток после заражения, снижению вирусной нагрузки (по ПЦР) в орофарингеальных мазках с 1 суток после заражения и снижению количества инфекционного вируса в лёгких на двух сроках эвтаназии. На двух сроках эвтаназии наблюдали достоверное снижение макроскопических и микроскопических признаков поражения легких.
Ремдесивир(A-5702)	Обнаруженные терапевтические эффекты проявляются в виде снижения частоты проявления клинических признаков инфекции вплоть до их полного исчезновения к концу эксперимента. Отмечено достоверное снижение массового коэффициента легких на 3-и сутки после заражения и снижение данного показателя на уровне тенденции на 7-е сутки. На двух сроках эвтаназии наблюдали тенденцию к снижению макроскопических и микроскопических признаков поражения легких. Введение тестируемой субстанции привело к достоверному снижению вирусной нагрузки (по ПЦР) в орофарингеальных мазках на 5-е сутки после заражения и снижению количества инфекционного вируса в лёгких на двух сроках эвтаназии.

Мишень/тест-система:

Ингибирование главной протеазы SARS-CoV-2

Метод детекции:

Флуоресценция

Активность:

Ингибирование

Положительный контроль:

Активность протеазы без ингибитора, активность протеазы в присутствии ингибитора-стандарта

Организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) совместно с Институтом биоорганической химии РАН и Научным центром исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова

Ссылка на описание метода:

PDF файл

Контактное лицо:

Кузнецова Александра Александровна

sandra-k@niboch.nsc.ru

Сайт организации

Краткое описание тест-системы:

Эффективность процесса ингибирования протеазы оценивается на основании предстационарного кинетического анализа, с регистрацией процесса, основанного на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Для регистрации ферментативного процесса используется модельный FRET-субстрат Dabcyl-KTSAVLQSGFRKM-E(Edans)-NH2, содержащий пару краситель-тушитель. FRET-анализ позволяет выявить изменения расстояния между красителем и тушителем в таких процессах, как встраивание пептида в активный центр фермента, сопровождающееся образованием специфических контактов между боковыми цепями субстрата и соответствующими аминокислотными остатками в активном центре фермента, что впоследствии приводит к образованию каталитического фермент-субстратного комплекса, гидролизу пептидной связи и высвобождению продуктов реакции.

Раствор фермента смешивают с ингибитором и инкубируют на льду 5 мин для получения комплекса фермент-ингибитор. После этого инициируют гидролиз субстрата путем быстрого перемешивания предформированного комплекса фермент-ингибитор с FRET-субстратом с помощью спектрофотометра остановленного потока SX20 (Applied Photophysics, Великобритания) и регистрируют изменение FRET-сигнала. Для оценки остаточной ферментативной активности используют начальный наклон кинетических кривых. Сравнение наблюдаемой константы скорости, полученной в присутствии исследуемого вещества, с наблюдаемой константой скорости, полученной в отсутствие ингибитора, либо в присутствии ингибитора-стандарта, позволяет сделать выводы об эффективности действия тестируемого вещества.

Протокол:

№	Процесс	Комментарии
1	Приготовление рабочих растворов субстрата и фермента.	Раствор 1: 500 мкл 5 мкМ FRET-субстрат Dabcyl-KTSAVLQSGFRKM-E(Edans)-NH2 в буферном растворе (20 mM Tris-HCl pH 7.3, 100 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, and 1.0 mM DTT). Раствор 2: 500 мкл 5 мкМ протеазы Mpro и 5 мкМ исследуемого ингибитора в буферном растворе (20 mM Tris-HCl pH 7.3, 100 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, and 1.0 mM DTT).
2	Инкубирование раствора фермента с ингибитором на льду в течение 5 мин.
3	Перенос растворов 1 и 2 в спектрофотометр остановленного потока SX20 (Applied Photophysics, Великобритания).	Инкубирование растворов в течение 5 мин при температуре 25°С.
4	Регистрация изменений FRET-сигнала.	Длина волны возбуждения λ_ex = 340 нм, интегральную интенсивность флуоресценции детектируют с использованием ФЭУ с установленным светофильтром GG-435 (Schott, Mainz, Germany).
5	Количественная обработка результатов эксперимента.	Origin 7.0 (OriginLab, США) и DynaFit (BioKin, США)
6	Сравнение наблюдаемой константы скорости, полученной в присутствии исследуемого ингибитора, с наблюдаемой константой скорости, полученной в отсутствие ингибитора, либо в присутствии ингибитора-стандарта.	Стандартными ингибиторами являются PF-00835231, GC-376, Boceprevir и Telaprevir.

Интерпретация результатов:

Количественную обработку результатов экспериментов проводят путем оптимизации параметров методом нелинейной регрессии, включающим численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих кинетику процесса (Origin 7.0 (OriginLab, США) и DynaFit (BioKin, США).

Для расчета наблюдаемых констант скорости, характеризующих изменение интенсивности флуоресценции, используют уравнение:

$$F_c = F_b + \sum_{i=0}^N A_i \times exp (-k_i \times t) $$

где F_c – экспериментальный сигнал, F_b – фоновое значение FRET-сигнала, i – номер стадии, А_i – амплитуда изменения сигнала, k_i – наблюдаемая константа скорости.

Предстационарный кинетический анализ взаимодействия протеазы с модельным субстратом, позволяет «разложить» процесс взаимодействия на отдельные стадии и определить характеристики этого взаимодействия. Кроме того, этот подход позволяет определить влияние любого химического вещества на эти стадии при его добавлении в реакционную смесь.

Сравнение наблюдаемой константы скорости, полученной в присутствии тестируемого вещества, с наблюдаемой константой скорости, полученной в отсутствие ингибитора, либо в присутствии ингибитора-стандарта, позволяет сделать выводы об эффективности действия тестируемого вещества.

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Для апробации быстрокинетической системы поиска ингибиторов основной протеазы коронавируса в качестве стандартных ингибиторов были использованы известные ковалентные ингибиторы протеазы: PF-00835231, GC-376, Boceprevir и Telaprevir. Данные соединения относятся к семейству ингибиторов цистеиновых протеаз и содержат реакционноспособные группы, необходимые для образования ковалентной связи между молекулой ингибитора и остатком Cys145 в активном центре фермента. Для выполнения такой апробации метода, раствор фермента смешивали с ингибитором и инкубировали на льду 5 мин для получения комплекса фермент-ингибитор. После этого инициировали гидролиз субстрата путем быстрого перемешивания предформированного комплекса с FRET-субстратом с помощью спектрофотометра остановленного потока и регистрировали изменение FRET-сигнала. Для оценки остаточной ферментативной активности использовали начальный наклон кинетических кривых. Сравнение полученных данных позволило сделать вывод, что как GC-376, так и PF-00835231 являются наиболее мощными ковалентными ингибиторами Mpro. Боцепревир показал промежуточный уровень активности, тогда как телапревир имел наименьший ингибирующий эффект. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными.

Дополнительные характеристики

Количество вещества для проведения одного исследования - 500 мкл, 5 мкМ исследуемого вещества.

Производительность тест-системы - 30 минут на одно соединение.

Ссылки описывающие методику в литературе:

1. Zakharova M.Yu., Kuznetsova A.A., Uvarova V.I., Fomina A.D., Kozlovskaya L.I., Kaliberda E.N., Kurbatskaia I.N., Smirnov I.V., Bulygin A.A., Knorre V.D., Fedorova O.S., Varnek A., Osolodkin D.I., Ishmukhametov A.A., Egorov A.M., Gabibov A.G., Kuznetsov N.A. Pre-Steady-State Kinetics of the SARS-CoV-2 Main Protease as a Powerful Tool for Antiviral-Drug Discovery. Frontiers in Pharmacology, 2021. V. 12, Article 773198. DOI: 10.3389/fphar.2021.773198

№	Процесс	Комментарии
1	Посев клеточной культуры на 6-луночный планшет	За сутки до начала эксперимента
2	Контроль конфлюэнтности монослоя	Визуально, с использованием светового микроскопа
3	Преинкубация препарата с клеточной культурой	1 час, при 5% СО₂ и t= 37֠°С
4	Инкубация вируса с клеточной культурой	2 часа, при 5% СО₂ и t= 37֠°С
5	Удаление инокулята, промывание монослоя поддерживающей средой и добавление твердой покровной среды с содержанием 0,9% агара
6	Инкубация клеточной культуры под покровной средой	3-6 суток в зависимости от штамма при 5% СО₂ и t= 37֠°С
7	Удаление покровной среды, фиксация и окрашивание клеток
8	Подсчет количества бляшек в каждой лунке

№	Процесс	Комментарии
1	Посев клеток Vero ССL81 и Calu-3 на 96-луночные планшеты, инкубация в атмосфере 5% CO₂ при 36°С до формирования полного монослоя	Одинаково для всех трех систем
2	Инфицирование клеток вирусом SARS-CoV-2, добавление препаратов в различных концентрациях и схемах	Одинаково для всех трех систем
3	Инкубация в атмосфере 5% CO₂ при 36°С	1 система- в течение 24-48 часов;* 2 система – в течение 24 часов; 3 система - в течение 5 суток до появления ЦПД.*
4	Определение эффекта, учет результатов	1 система - определение инфекционного титра супернатантов, отобранных после инкубации вируса в присутствии и отсутствии препаратов путем титрования их в культуре клеток;* 2 система – постановка ИФА с использованием антител к различным вирусным белкам; 3 система- учет ЦПД в инфицированной культуре клеток в присутствии и отсутствии препаратов визуально и количественно по жизнеспособности клеток при окрашивании их формазановыми красителями (МТТ, ХТТ).*

№	Процесс	Комментарии
1	Приготовление рабочих растворов соединений в ДМСО
2	Титрование соединений в 96-луночном планшете
3	Внесение в лунки псевдовирусных частиц
4	Инкубация соединений с псевдовирусными частицами	1 час, 37°С, 5% CO₂
5	Внесение клеток в лунки	Концентрация клеток (1.5 × 10⁴ клеток/лунку)
6	Инкубация клеточной культуры с псевдовирусными частицами	48 часов при 37°С, 5% CO₂
7	Детекция люминесценции с помощью набора Luciferase Assay System (Promega, США)
8	Статистическая обработка данных	Prism 6 (GraphPad Software, США)>

Тест-система:

Бесклеточная система скрининга потенциальных ингибиторов протеазы Mpro (3CLpro) SARS-CoV-2 на основе методов флуоресцентного анализа: дифференциальной сканирующей флуориметрии и микротермофореза

Мишень:

Протеаза 3CLpro (Mpro) SARS-CoV-2

Метод детекции:

Флуоресценция, коэффициент термодиффузии

Активность:

Связывание: константа диссоциации

Положительный контроль:

Положительный контроль: ингибитор кальпаина

Организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Ссылка на описание метода:

PDF файл

Контактное лицо:

Коневега Андрей Леонидович

konevega_al@pnpi.nrcki.ru

Контактное лицо:

Виноградова Дарья Сергеевна

vinogradova_ds@pnpi.nrcki.ru

Сайт организации

Краткое описание тест-системы:

Анализ эффективности взаимодействия основной протеазы 3CL-Pro (NSP5) коронавируса SARS-CoV-2 с потенциальными ингибиторами проводится методом микротермофореза. Для постановки эксперимента анализируемый белок флуоресцентно метится. Отсутствие конформационных изменений, а также степень агрегированности препарата контролируется методом дифференциальной сканирующей флуориметрии. Измерение взаимодействия флуоресцентно меченного белка с потенциальным ингибитором проводится в растворе без иммобилизации образцов.

Для анализа конформационной стабильности протеазы методом дифференциальной сканирующей флуориметрии раствор белка загружается в стеклянные капилляры и подвергается последовательному нагреву в диапазоне температуры 15° – 95°С с шагом 1°С/мин.

Анализ взаимодействия флуоресцентно меченного препарата белка с лигандом проводится в стеклянных капиллярах при постоянной концентрации белка и различных концентрациях анализируемого соединения.

Протокол:

Для анализа конформационной целостности и агрегационной устойчивости препарата протеазы 3CL-Pro (NSP5) методом дифференциальной сканирующей флуориметрии образец белка в объеме 10 мкл загружается в стеклянные капилляры (Standard capillaries Prometheus NT.48, NanoTemper Technologies GmbH) и помещается на термоплатформу. Анализ изменения конформации белка в условиях тепловой денатурации проводится по детекции изменения флуоресценции ароматических аминокислотных остатков, входящих в его состав. Возбуждение флуоресценции осуществляется с помощью светодиода при длине волны 285 нм. Измерение флуоресценции проводится одновременно с помощью двойного UV-детектора на длинах волн 330 нм и 350 нм каждые 3 секунды сканирования всей платформы. Во время эксперимента образцы измеряются непрерывно, что обеспечивает сверхвысокое разрешение с более чем 20 экспериментальными точками в минуту. Образцы нагреваются в диапазоне от 15°С до 95°С с шагом от 1°С/мин. Одновременно с определением конформационной стабильности белковой молекулы в процессе тепловой денатурации детектируются коллоидные свойства раствора, дающие информацию об агрегационной устойчивости образца. Детектирование проводится с помощью дополнительной оптики путем измерения потери интенсивности отраженного света в результате рассеивания.

Анализ взаимодействия протеазы с потенциальными ингибиторами проводится в растворе методом микротермофореза. Для проведения эксперимента протеаза 3CL-Pro (NSP5) метится флуоресцентным красителем (Monolith His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation, Nanotemper Technologies GmbH) по шести остаткам гистидина на С-конце белка. В данном случае флуоресцентная метка не нарушает активный центр белка. Краситель обладает высокой аффинностью к анализируемому белку при значении константы диссоциации K_D = (11 ± 3) нМ.

Эксперимент по анализу степени сродства анализируемых лигандов проводится в условиях последовательного титрования. Готовится 16 реакционных смесей, где флуоресцентномеченый белок поддерживается в постоянной концентрации, анализируемый лиганд - в изменяющейся. После этого реакционные смеси инкубируются в темноте при 25°С в течение 30 минут. После инкубации смеси центрифугируются в течение 3 минут, 13000 об/мин при 25°С. Далее образцы последовательно загружаются в стеклянные капилляры (Standard capillaries Monolith NT.115, NanoTemper Technologies GmbH) и проводится эксперимент. Реакционный буфер для проведения эксперимента: 50 мМ HEPES-K, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0.02% Tween-20, 10% глицерин, рН 7.6. Измерение проводится при интенсивности детектирующего лазера 30%, инфракрасного лазера 40%.

Интерпретация результатов:

Анализ данных тепловой денатурации проводится с использованием программного обеспечения установки – PR. ThermControl v.2.0.2.

Построение кривых и анализ данных, полученных методом микротермофореза осуществляется с помощью программы GraphPad Prism. Полученные значения аппроксимируются нелинейной регрессией квадратичной функции:

$$\mathsf y = \mathsf y_{min} + {(\mathsf y_{max}-\mathsf y_{min}) \times \biggl((z+x+K_D) - \sqrt{(z+x+K_D)^2 - 4zx}\biggr) \over 2z}$$

где x – концентрация лиганда, z – концентрация флуоресцентномеченого компонента (постоянная величина для конкретного эксперимента).

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Для проверки корректности условий экспериментальной системы проводили контрольный анализ взаимодействия белка с кальпаиновым ингибитором методом микротермофореза, где флуоресцентномеченый NSP5 поддерживался в постоянной концентрации, составляющей 50 нМ при изменяющейся концентрации кальпаинового ингибитора. В качестве условий проведения эксперимента была выбрана инкубация при температуре 25°С в течение 30 минут. Интенсивность детектирующего лазера составляла 80%, ИК-лазера 40%. Полученное значение константы диссоциации отражало связывание в микромолярном диапазоне: K_D = 5±2 мкМ.

Дополнительные характеристики

Количество вещества для проведения одного исследования - от 4 мкл белка, содержащего флуорофор в концентрации 50 нМ.

Производительность тест-системы - 15 мин на одно измерение аффинности.

Ссылки описывающие методику в литературе:

1. Vinogradova D.S., Zegarra V., Maksimova E., Nakamoto J.A., Kasatsky P., Paleskava A., Konevega A.L., Milón P. How the initiating ribosome copes with ppGpp to translate mRNAs // PLoS biology. - 2020. - Vol. 18. - P. e3000593. DOI: 10.1371/journal.pbio.3000593

2. Bartoschik T., Galinec S., Kleusch C., Walkiewicz K., Breitsprecher D., Weigert S., Muller Y.A., You C., Piehler J., Vercruysse T., Daelemans D., Tschammer N. Near-native, site-specific and purification-free protein labeling for quantitative protein interaction analysis by MicroScale Thermophoresis // Scientific Reports. - 2018. - Vol. 8. - P. 4977. DOI: 10.1038/s41598-018-23154-3

Задайте пожалуйста ваш вопрос

Тест-системы

Потенциальные ингибиторы Mpro

Скрининг методом быстрой кинетики

SARS-CoV2 в клеточной культуре Vero E6

Активность препаратов прямого действия

Ингибиторы 3CL протеазы SARS-CoV-2

Бесклеточная система скрининга

Бесклеточная система скрининга ингибиторов протеазы 3CLpro (Mpro) SARS-CoV-2

Протеаза 3CLpro (Mpro) SARS-CoV-2

Флуоресценция, FRET

Ингибирование протеазы: IC50, константа ингибирования

ингибиторы PF-00835231 либо GC-376, в ДМСО

ДМСО

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Осолодкин Дмитрий Иванович

Краткое описание тест-системы:

Протокол:

Интерпретация результатов:

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Дополнительные характеристики:

Дополнительная информация:

Ссылки описывающие методику в литературе:

Система скрининга противовирусной активности ингибиторов репродукции SARS-CoV-2

Коронавирус SARS-CoV-2 (варианты: прототипный В.1.1, B.1.617.2 Дельта, BA.1. Омикрон, XBB.1.9 и другие)

Vero

Микроскопия

Ингибирование репродукции вируса: EC50

PF-00835231, GC-376, N4-гидроксицитидин в ДМСО

ДМСО

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Любовь Игоревна Козловская

Краткое описание тест-системы:

Протокол:

Интерпретация результатов:

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Дополнительные характеристики:

Дополнительная информация:

Ссылки описывающие методику в литературе:

Система оценки противовирусной активности ингибиторов репродукции SARS-CoV-2 in vivo

Коронавирус SARS-CoV-2 (варианты: прототипный В.1.1, B.1.617.2 Дельта, BA.1. Омикрон)

Сирийские хомяки (6-8 недель, 50-80 г)

Клиническое наблюдение, выделение вируса или вирусной РНК из лёгких и мазков, макро- и микроскопическое исследование тканей лёгких

Улучшение параметров по сравнению контролем в течение 7 дней после интраназального заражения при выбранном способе введения соединений (в/м, в/ж, и/п)

по обсуждению

заражённые животные без препарата

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Александр Сергеевич Лунин

Краткое описание тест-системы:

Протокол:

Интерпретация результатов:

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Дополнительные характеристики

Дополнительная информация:

Ссылки описывающие методику в литературе:

Ингибирование главной протеазы SARS-CoV-2

Флуоресценция

Ингибирование

Активность протеазы без ингибитора, активность протеазы в присутствии ингибитора-стандарта

Кузнецова Александра Александровна

Краткое описание тест-системы:

Протокол:

Интерпретация результатов:

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Дополнительные характеристики

Ссылки описывающие методику в литературе:

Оценка снижения репродукции вируса SARS-CoV2 в клеточной культуре Vero E6

Vero E6

Визуальный

Ингибирование бляшкообразования

Молнупиравир

ДМСО

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт грипа им.А.А.Смородинцева» Минздрава России

Штро Анна Андреевна

Краткое описание тест-системы:

Протокол:

Интерпретация результатов:

Препарат сравнения, использованный для валидации методики; результаты валидации:

Дополнительные характеристики

Ссылки описывающие методику в литературе:

Ингибирование репродукции вируса: EC₅₀

PF-00835231, GC-376, N⁴-гидроксицитидин в ДМСО